Príprava biologických vzoriek, ako sú kosti, rastliny, svaly alebo spútum, na analýzu DNA, RNA, proteínov alebo metabolitov môže byť náročná. Spoločnosť RETSCH ponúka laboratórne mlyny a drviče, ktoré rozomieľajú a homogenizujú pevné vzorky, ale sú vhodné aj na rozrušovanie buniek. Mlynčeky RETSCH sa používajú v oblastiach, ako sú biotechnológie, diagnostika, forenzná medicína, poľnohospodárstvo a mikrobiológia.
Narušenie buniek je často zvolenou metódou na extrakciu bunkových zložiek z baktérií, kvasiniek, húb alebo mikrorias a vykonáva sa buď chemicky, alebo mechanicky. Mechanické metódy sú vhodnejšie pre bunky s pevnými stenami alebo ak by chemické látky mohli ovplyvniť extrakciu, a preto je potrebné sa im vyhnúť. Bežnou a účinnou metódou je šľahanie korálkami, pri ktorom sa na strihanie buniek v suspenzii používajú korálky. Šľahanie korálikov sa môže vykonávať v malom alebo veľkom rozsahu s použitím rôznych typov fľaštičiek a skúmaviek. Jedným zo spôsobov je zmiešať suspenziu s guľôčkami a použiť vírový mixér. Tento postup je však pomalý a nekonzistentný, najmä pri veľkom počte vzoriek alebo dlhom čase rozrušovania. Lepším spôsobom je použitie oscilačných mlýnov RETSCH s adaptérmi, ktoré proces automatizujú, vďaka čomu je rýchly, efektívny a reprodukovateľný.
Oscilačný mlyn MM 400 - narušenie kvasinkových buniek*
*Video ukazuje predchádzajúci model s identickým funkčným princípom.
Zvýšená reprodukovateľnosť celkovej koncentrácie bielkovín po rozpojení buniek, 7 min.
MM 400, 12 min Vortex.
Chybové úsečky: % štandardnej odchýlky
MM 400 spracuje až 20 vzoriek v 1,5 alebo 2 ml skúmavkách Eppendorf bez krížovej kontaminácie, čo šetrí čas obsluhy. Okrem toho je k dispozícii adaptér, ktorý umožňuje umiestniť až osem 50 ml skúmaviek Falcon. Optimálna veľkosť guľôčok na rozrušovanie buniek sa líši v závislosti od typu buniek; pre baktérie a kvasinky sa odporúčajú sklenené guľôčky s veľkosťou od 0,75 do 1,5 mm, zatiaľ čo pre huby a mikroriasy sú vhodnejšie menšie guľôčky v rozsahu od 0,1 do 0,5 mm.
Na extrakciu DNA alebo RNA sú ideálne menšie jednorazové skúmavky s objemom do 2 ml, zatiaľ čo na spracovanie proteínov alebo metabolitov sú vhodné väčšie skúmavky, ako napríklad 50 ml skúmavky Falcon. Optimálne parametre vyklepávania guľôčok sa líšia v závislosti od typu buniek. Na nájdenie najlepších výsledkov môže byť potrebné experimentovať. Zvyčajne je na úplné narušenie buniek potrebných 30 s (väčšina mikrorias) až 7 min (kvasinky všeobecne) šľahania guľôčok.
Tým, že oscilačný mlyn MM 500 vario akceptuje až päťdesiat 2 ml jednorazových fľaštičiek, účinne zvyšuje priepustnosť vzoriek.
Bunky Phaeodactylum tricornutum pred (vľavo) a po narušenie buniek (vpravo) pomocou oscilačného mlynčeka MM 400 v kombinácii s adaptérom Falcon tube.
Teplota zohráva rozhodujúcu úlohu najmä pri aplikáciách, kde ide o proteíny citlivé na teplotu. Jedným riešením je kryogénne mletie (pozri príslušnú časť), druhým je chladenie bunkovej suspenzie. V prípade MM 400 sa ukázalo, že nárast tepla v 2 ml skúmavkách je mierny aj pri 30 Hz; jednoduchým spôsobom je prerušiť časy prerušenia > 1 min chladením adaptéra s fľaštičkami v ľadovom kúpeli počas jednej minúty. Týmto spôsobom sa teplota udrží pod 12 - 15 °C v závislosti od použitej veľkosti guľôčok.
Zvýšenie teploty počas rozrušovania buniek v MM 400 pri 30 Hz alebo s Vortexerom, chladenie na ľade po každej minúte rozrušovania buniek
Spôsob, ako kontrolovať vývoj teploty počas guľôčkového mletia, je použitie Oscilačného mlyna MM 500 control. Špeciálny adaptér pojme osemnásť 2 ml jednorazových fľaštičiek na jednu dávku. Stroj je pripojený k chladiacemu zariadeniu s vodou ochladenou na 4 °C, ktoré potom ochladzuje adaptér držiaci fľaštičky. Týmto spôsobom sa teplota suspenzie udržiava na približne 13 °C, ale bez nepríjemných fáz manuálneho prerušovania v ľadovom kúpeli. Hoci MM 500 control neakceptuje jednorazový adaptér Falcon tube, môže sa používať s nerezovými nádobkami na mletie s objemom 50, 80 alebo 125 ml (pozri príklad vľavo: P. pastoris).
Ak sa mlynček používa s tekutým dusíkom a zariadením CryoPad a je nastavený na 0 °C, teplota bunkovej suspenzie v 2 ml jednorazových skúmavkách sa môže udržiavať aj pri 0 °C bez zmrazenia suspenzie, takže je stále možná účinná disperzia guličiek.
Niektoré biologické vzorky, ako napríklad spútum pacientov s cystickou fibrózou alebo vzorky tkanív, napríklad pečene, pľúc alebo nádorov, je niekedy ťažšie úplne homogenizovať. Skúmavky na jedno použitie s objemom 2 ml sú často príliš malé na to, aby sa do nich zmestil celý objem vzorky, preto sa vzorka musí po procese homogenizácie rozdeliť a znovu skombinovať, čo zvyšuje množstvo práce a času v laboratóriu.
Do väčších mlynčekov vyrobených napríklad z nehrdzavejúcej ocele sa zmestí celý objem vzorky, ale po každom použití sa musia vyčistiť. Adaptér pre oscilačných mlynov MM 400 rieši tento problém tým, že umožňuje používať jednorazové skúmavky s objemom 5 x 5 ml, ktoré majú väčšiu kapacitu a nevyžadujú čistenie. Na jednu dávku možno homogenizovať 10 vzoriek súčasne. Na homogenizáciu vzoriek tkanív sa môžu používať aj 50 ml skúmavky Falcon. V tomto prípade možno spracovať 8 vzoriek na dávku len v priebehu niekoľkých minút.
Vzorka pečene pred a po homogenizácii v MM 400
Niektoré biologické vzorky, ako napríklad vláknité rastliny, tvrdé žily, nechty alebo niektoré živočíšne či nádorové tkanivá, sa v pufrovacom systéme ťažko homogenizujú. Sú buď príliš mäkké, alebo príliš tvrdé, alebo príliš vláknité, aby sa dali účinne rozpustiť v suspenzii. Lepšou alternatívou pre tieto vzorky je kryogénne mletie, ktoré zahŕňa ich zmrazenie tekutým dusíkom pred alebo počas procesu mletia. Vďaka tejto technike sú vzorky krehké a dajú sa ľahko rozdrviť na homogénny prášok. Výhodou kryogénneho mletia je aj zachovanie integrity napr. proteínov alebo prchavých zlúčenín, ktoré by sa pri vyšších teplotách mohli rozkladať alebo vyparovať. Okrem toho kryogénne mletie môže rozbiť vnútrobunkové organely niektorých organizmov, ako sú kvasinky.
V prípade vzoriek, ktoré sú lepkavé, ako napríklad bobule, je kryogénne mletie často jedinou možnou metódou na získanie rovnomernej vzorky. V tabuľke sú uvedené niektoré príklady vzoriek materiálov, ktoré boli úspešne spracované kryogénnym mletím v oscilačním mlýně MM 400 nebo v mlýně CryoMill. Na kryogénne mletie v MM 400 možno použiť 2 ml oceľové skúmavky. Podobné účinky možno dosiahnuť v MM 500 control s mlecími nádobami s objemom až 125 ml pre väčšie objemy vzoriek. Tu sa na prácu s kvapalným dusíkom musí použiť zariadenie CryoPad. Vo všetkých uvedených mlynčekoch sú k dispozícii aj 2 ml nerezové skúmavky a príslušné adaptéry pre menšie objemy vzoriek.
2 ml skúmavky z nerezovej ocele
| Vzorka | Príslušenstvo | Vstupné množstvo | Čas mletia | Rýchlosť | Maximálna výstupná veľkosť zrna (d90)/ |
| E. coli baktérie |
|
2 x 10 ml zmrazených bunkových peliet | 2 min | 30 Hz | úplné narušenie buniek |
| svalové tkanivo |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | <150 µm |
| borovicové ihličie |
|
3 min | 30 Hz | Reprodukovateľná extrakcia RNA z 20 vzoriek v jednom kroku | |
| bobule |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| nechty na rukách |
|
1 klinec na ampulku | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| krysie črevá |
|
1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
Kúsky mäsa pred a po kryogénnom mletí
Lepkavé bobule
pred a po kryogénnom mletí
Borovicové ihličie
pred a po kryogénnom mletí
Agarózový gél na separáciu RNA z rozprášeného borovicového ihličia, ktorý ukazuje dobrú reprodukovateľnosť a množstvo pripravenej RNA
Forenzné vzorky, ako sú vlasy, kosti a zuby, sú väčšinou krehké, a preto ich zvyčajne nie je potrebné pred rozprašovaním chladiť. Aby sa dosiahla požadovaná analytická jemnosť, vzorky sa možno budú musieť predbežne rozdrviť v čeľusťovom drviči alebo v střižnom mlyne, aby sa veľkosť častíc znížila pod 10 mm na ďalšie spracovanie v guľovom mlyně. Rezné mlyny sa používajú na predbežné drvenie kostí, ktoré môžu byť čerstvé, a teda nie úplne suché, a môžu dokonca obsahovať zvyšky mäsa.
Spoločnosť RETSCH ponúka celý rad rezacích mlynov na primárne zmenšenie veľkosti mäkkých, stredne tvrdých, pružných, húževnatých a vláknitých vzoriek materiálov. Široký sortiment príslušenstva umožňuje optimálne prispôsobenie rôznym aplikáciám. Mlynček SM 300 je možné vybaviť tromi rôznymi rotormi a spodnými sitami od 0,25 mm do 20 mm. Na rozdiel od čerstvých a mastných kostí možno suché kosti zmenšiť na veľkosť menšiu ako 0,25 mm v jednom alebo dvoch krokoch. Model SM 300 má variabilné otáčky od 100 do 3 000 ot/min. Rozdrvenie kostí, zubov alebo vlasov sa väčšinou vykonáva v guľových mlynoch s použitím mlecích guľôčok > 5 mm vyrobených z ocele, oxidu zirkónia alebo karbidu volfrámu.
Vzorka kosti pred a po mletí v strižnom mlyne
Ľudské vlasy pred a po jemnom mletí v oscilačnom mlyne
Jednou z možných komplikácií pri operácii kĺbovej náhrady, napríklad lakťového alebo kolenného kĺbu, je infekcia okolitého tkaniva rôznymi baktériami. Tieto infekcie, nazývané protetické kĺbové infekcie (PJI), sa môžu objaviť kedykoľvek od niekoľkých dní až po niekoľko rokov po operácii. Je ťažké ich liečiť, pretože ich môžu spôsobiť rôzne druhy baktérií a nie vždy sa dajú odhaliť bežnými metódami. Preto je potrebné izolovať baktérie zo vzoriek tkaniva spôsobom, ktorý zachová ich životaschopnosť a umožní ich identifikáciu a kultiváciu.
Práve tu môže pomôcť Oscilačný mlyn MM 400 s jednoduchým postupom: Vzorky sa zmiešajú s 20 ml sterilnej demineralizovanej vody a 5 ml sklenených guličiek s priemerom 1 mm v sterilizovanej oceľovej nádobe. Môžu sa použiť jednorazové 30 ml fľaše so širokým hrdlom. Až 8 fliaš sa pretrepáva 3,5 min pri frekvencii 30 Hz, aby sa zo vzoriek odstránili baktérie bez ich zničenia. Baktérie sa potom dajú ľahko vypestovať na agarovej platni na ďalšiu analýzu. Táto metóda má vysokú mieru detekcie (A.-L. Roux et. al 2010) a môže sa použiť na akúkoľvek pevnú vzorku infikovaného tkaniva, aj keď obsahuje implantovaný materiál.
Produkty a služby spoločnosti RETSCH sú dostupné prostredníctvom globálnej siete dcérskych spoločností a plne vyškolených distribútorov. Naši pracovníci vám radi pomôžu s akýmkoľvek dopytom, ktorý by ste mohli mať.
Michanie guľôčkami, mechanická metóda široko používaná na rozrušovanie buniek, je rozhodujúca na extrakciu bunkových zložiek z mikroorganizmov, ako sú baktérie, kvasinky, huby alebo mikroriasy. Tento proces zahŕňa použitie korálikov na strihanie buniek v suspenzii a môže sa vykonávať v rôznom rozsahu s použitím rôznych fľaštičiek a skúmaviek. Automatizácia, ktorú poskytujú oscilačné mlyny RETSCH s adaptérmi, zefektívňuje proces míchania guľôčok a zabezpečuje jeho rýchlosť, účinnosť a reprodukovateľnosť.
Optimálna veľkosť a parametre guľôčok závisia od typu bunky, čo si vyžaduje experimentovanie na dosiahnutie najlepších výsledkov. Napríklad model MM 400 dokáže spracovať až 20 vzoriek v 1,5 alebo 2 ml skúmavkách Eppendorf bez krížovej kontaminácie. Dostupný adaptér umožňuje umiestniť až osem 50 ml skúmaviek Falcon, čo zvyšuje univerzálnosť procesu.
Kryogénne mletie je nevyhnutné pri manipulácii s náročnými vzorkami, ktoré odolávajú homogenizácii v bežných pufrovacích systémoch. To platí najmä pre vláknité rastliny, tvrdé žily, nechty alebo špecifické živočíšne či nádorové tkanivá. Táto technika zahŕňa použitie kvapalného dusíka na zmrazenie vzoriek buď pred, alebo počas procesu mletia. Týmto kryogénnym zmrazením sa vzorky stávajú krehkými, čo uľahčuje ich drvenie na homogénny prášok.
Proces kryogénneho mletia má výrazné výhody, pretože zachováva integritu proteínov alebo prchavých zlúčenín, ktoré by sa pri vyšších teplotách mohli rozložiť alebo odpariť. Okrem toho sa ukazuje ako účinný pri rozbíjaní vnútrobunkových organel v niektorých organizmoch. Kryogénne mletie je jedinou možnou metódou na dosiahnutie jednotných vzoriek lepkavých materiálov, ako sú napríklad bobule.
Na dosiahnutie optimálnych výsledkov sa kryogénne mletie môže vykonávať pomocou špecializovaného zariadenia, ako je CryoMill alebo Mixer Mill MM 400, ktoré pojme 2 ml oceľové skúmavky. Ovládanie Mixer Mill MM 500, ktoré je špeciálne navrhnuté na prácu s kvapalným dusíkom (LN2), akceptuje väčšie mlynčeky s objemom až 125 ml.
Pokiaľ ide o drvenie forenzných vzoriek, ako sú kosti alebo zuby, optimálnou voľbou pre prvý krok procesu zmenšovania sú čeľusťové drviče alebo strižné mlyny. Spoločnosť RETSCH ponúka rôznorodý sortiment strižných mlynov určených na primárne zmenšenie veľkosti rôznych materiálov vzoriek vrátane mäkkých, stredne tvrdých, pružných, húževnatých a vláknitých materiálov. Rozsiahly sortiment príslušenstva zaručuje, že tieto mlyny možno ľahko prispôsobiť rôznym aplikáciám.
Napríklad všestranný mlyn SM 300 sa môže pochváliť tromi rôznymi rotormi a spodnými sitami v rozsahu od 0,25 mm do 20 mm spolu s variabilnými otáčkami od 100 do 3 000 ot/min. Táto flexibilita z neho robí vynikajúci nástroj na prispôsobenie špecifickým potrebám spracovania forenzných vzoriek.
Na ďalšie kroky spracovania zvážte použitie guľových mlynov vybavených mlecími guľôčkami väčšími ako 5 mm, vyrobenými z materiálov, ako je oceľ, zirkón alebo karbid volfrámu. Oscilačné mlyny, ako napríklad MM 400, sú najlepšou voľbou na mletie vlasov.
